药品检验用培养基的验证

当一种品牌的培养基在某药厂开始启用的时候，一般先需要进行验证。下面根据《中国药典》2015年版，对验证方法进行阐述。

一：无菌检查

全过程应无菌操作。环境的洁净度应符合无菌检查的要求。

对无菌检查用培养基的要求：干粉培养基加纯水溶解并高压灭菌后，溶液应澄清，无沉淀。

培养基进行无菌试验，应无菌生长，还需灵敏度测试合格（已知试验菌株）。

培养基的适用性检查：

1、无菌性检查。2、灵敏度检查

无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。

要点：空白培养，看是否长菌。

灵敏度检查（简要）：获取特定菌种（如金葡、铜绿），制备菌液，使每ml含菌数小于100cfu。菌液在室温应2小时内使用，在2-8度应24小时内使用。

Ø取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；

Ø取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。

Ø结果判定：空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均生长良好。

要点：接种试验菌量小于100cfu，看是否生长，以观察灵敏度。

方法的适用性检查：

菌种与菌液制备同上。

薄膜过滤法：取每种培养基规定接种的供试品总量，按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。培养时间不得超过5天。

直接接种法：取硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管。取胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接入小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，培养时间不得超过5天。

结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检査。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。

要点：用试验菌测试，看供试品中是否有抑菌物质。如果有，则应使用中和剂或者增加冲洗量。

二、微生物限度检查

1）微生物计数法

方法分为平皿法（倾注法、涂布法）、薄膜过滤法、MPN法(最可能数法)。

MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。

培养基适用性试验

制备试用菌液。设立阴性对照。

接种不大于100cfu的试验菌液。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5〜2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。

要点：使用“对照培养基”，被检培养基与对照培养基培养结果应近似。同时，接种试验菌液量不大于100CFU。

方法适用性试验:

制备供试液。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。

(1)试验组 取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1ml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100cfu。

(2)供试品对照组 取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

(3)菌液对照组 取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。

若有抗菌活性，则应增加稀释液或培养基体积，或加入适宜的中和剂或灭活剂以去除或灭活。

平皿法：取供试液1ml（倾注法），置90mm的无菌平皿中，注入15〜20ml温度不超过45°C熔化的TSA或SDA培养基，混勻，凝固，倒置培养。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。若为涂布法，则供试液量不少于0.1ml。

薄膜过滤法：滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。取供试液适量（一般取相当于1g、1ml或10cm2的供试品，若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中，混勻，过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。滤膜菌面朝上培养基上培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

MPN法：仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用。该法不适用于霉菌计数。（略）

结果判断

对于前两法，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5〜2范围内；采用MPN法时，试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内。方法适用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。

要点：存在三组即样品+试验菌液、样品+稀释液、稀释液+试验菌液。样品中也含有菌。三组设定主要是为排除样品对试验菌液生长的影响，近似Spike试验。“样品+试验菌液”减去“样品+稀释液”，应接近“稀释液+试验菌液”的情况，才算合格。

2）控制菌检查法

如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。

培养基适用性检查（使用对照培养基，还需制备试验用的阳性菌株）。

菌种及菌液制备

设阴性对照，应无菌生长

培养基进行促生长能力、抑制能力及指示特性的检査。如下表。

促生长能力和指示特性检查：接种不大于100cfu的试验菌

抑制能力检查：接种不小于100cfu的试验菌

控制菌检查方法适用性试验

供试液制备

试验菌液制备

取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；

采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤后，注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检查方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。

结果判断

上述试验若检出试验菌，则合格；若未检出试验菌，则应消除供试品的抑菌活性，并重新试验。如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。

要点：看试验菌液能否检出。在最后一次冲洗液中加入。能检出即为合格。

三、培养基模拟灌装试验

此条依据食药监局发布的《无菌工艺模拟试验指南（无菌制剂）》征求意见稿。

“确保灭菌后培养基的促生长能力，避免过度灭菌使培养基碳化造成其促生长性能的降低。为避免过度加热可采用湿热灭菌与除菌过滤联合使用的方式，但均应进行促生长能力试验。”

“6.3.5.1. 应在无菌工艺模拟试验前及14天培养后按照现行中国药典方法对培养基进行促生长能力试验。

6.3.5.2. 促生长能力试验使用的菌种包括：白色念珠菌（CMCC98001）、黑曲霉（CMCC98003）、枯草芽孢杆菌（CMCC63501）、金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、铜绿假单胞菌（CMCC10104）和生孢梭菌（CMCC64941）等。除标准菌株之外，还应考虑加入环境和无菌检查中发现的典型微生物。促生长试验接种量应不大于100CFU，按照中国药典要求培养，以证明培养基能够支持微生物的生长。”

“其它模拟介质的评价

  在使用模拟介质前应对其适用性进行确认，包括无菌试验、抑菌试验、溶解度试验等。抑菌试验通常使用枯草芽孢杆菌（CMCC63501）和白色念珠菌（CMCC98001）。除此之外，还应考虑加入环境和无菌检查中发现的典型微生物。无菌模拟介质由无菌注射用水分散，然后加入到无菌培养基中，达到模拟工艺选用的浓度范围。然后在每份培养基中接种10-100CFU。阳性对照接种到不含无菌模拟介质的试管中，在20-25℃培养7天所有试管应明显浑浊。”