新型实时NAT检测法：高效、精准识别细胞培养中的支原体污染

细胞系的支原体污染是一种常见的情况，可能以多种方式影响细胞系的行为。支原体污染通常不明显，因此应经常检测细胞系。市面上有几种用于支原体检测的试剂盒，但欧洲药典培养方法可能需要数周时间才能产生结果，仍被认为是“金标准”方法。因此，需要具有相当灵敏度、特异性和物种范围的快速替代方法。在这里，我们描述了一种内部控制的基于Taqman的实时PCR检测，用于细胞培养基，无需DNA提取。该测定可以检测哺乳动物细胞培养物中最常见的支原体污染物的不到 10 CFU。经过验证的检测方法有可能用作基于细胞培养的生物制品生产中的常规测试。

在一项研究中，科研人员描述了一种新的实时检测方法，该方法使用56种PCR引物的混合物直接从培养基中有效扩增多种支原体种类，而无需进行DNA提取。实时分析由Taqman探针介导至高度保守区域。使用另一种标记的Taqman探针至工程基因组DNA模板，以促进对抑制物质的管内控制。该方法显示出高特异性、敏感性和检测准确性。该方法有可能符合欧洲药典（Ph. Eur.）2.6.7对于基于NAT的支原体检测的要求，因此可能是对用于生物制品生产的细胞系进行培养测试的廉价、简单且有效的替代方法。

历史估计细胞系中支原体污染的发生率高达35%，但现在支原体污染受到的关注比以前更多了，因此这一估计可能过高了。然而，最近对DNA序列数据库的计算机分析发现，美国国家生物技术信息中心（NCBI）序列读取档案中啮齿动物和灵长类动物条目的11%被支原体序列污染，1000基因组项目中的样本至少有7%被支原体污染，但尚不清楚污染是来自细胞培养还是实验和数据处理步骤。

本研究的主要目的是提供验证数据，以支持使用新开发的广谱单管NAT（核酸扩增技术）检测细胞培养物中支原体污染的方法。科研人员还寻求确定该检测方法与传统的琼脂培养法（被广泛认为是支原体检测的金标准）相比，其性能是否相当。该研究使用德国MB公司生产的支原体检测标准品进行试验。