生物制品中支原体检测的方法

生物制品中支原体检测的方法主要包括以下几种：

一、培养法

原理：从样品细胞培养体系中取样，接种到适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上生长，最终形成明显可见的特征性菌落。

优点：操作规范的情况下，很少会出现假阴性结果，检测精确度很高，因此被誉为支原体检测金标准，也是《美国药典》中认可的支原体检测方法之一。

缺点：

检测时间较长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。

无法对曾经感染过的样品做出判断。

能鉴定的支原体种类有限，例如支原体M. Hyorhinis等无法被检测出来。

二、指示细胞法（DNA染色法）

原理：将供试品接种于无污染、标准化的指示细胞（如Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）中培养，然后用特异荧光染料进行染色。支原体中的核酸可以被着色，如果待检测细胞中含有支原体，就会导致指示细胞被感染，进而在细胞膜或培养基等处发现蓝色荧光。

优点：

可用于检测一些不易培养的支原体，如猪鼻支原体。

耗时较短，同时可对多个样品进行检测。

缺点：

存在假阳性和假阴性的可能。例如，一些死亡细胞释放出来的DNA会被染成蓝色，导致假阳性；或由于荧光过弱而出现假阴性，使结果出现偏差。

口腔支原体和精氨酸支原体对细胞或盖玻片吸附能力较差，容易出现检测时的假阴性。

三、核酸法

原理：通过对样品中可能存在的支原体DNA进行扩增并检测，来判断样品是否被支原体污染。常用的核酸法主要有常规PCR法和荧光定量PCR法（qPCR）。

优点：

快速、敏感、方便，可实现对生物制品生产中所需的大部分原辅材料和半成品的支原体检验。

qPCR法还具有较高的特异性和灵敏度，且易于自动化操作。

缺点：

qPCR法检测支原体的能力依赖于扩增引物序列的广泛性和特异性，不同的核酸提取方法、扩增反应体系及扩增程序可能会对阳性样本的检出效率产生影响。

qPCR法检出的是支原体的基因组，无法鉴别样品中的支原体是否存活或是否为支原体相近种属的微生物污染。因此，需要进行方法学验证。

四、ELISA法

原理：基于抗原与抗体特异性结合的原理，通过检测样品中支原体特异性抗体或抗原的存在来判断支原体感染情况。

优点：操作简单、特异性和敏感性均比较强。

缺点：对检测环境和仪器的要求较高，容易发生交叉感染。

五、其他方法

除了上述方法外，还有一些其他方法如高通量测序（NGS）法、激光力细胞学（LFC）法等，这些方法在灵敏度、简便性和快捷性方面可能具有优势，但需要经过验证后才能考虑作为支原体检测的补充方法。

总的来说，在选择支原体检测方法时，应根据实际的应用场景、检测需求以及成本等因素进行综合考虑。同时，为确保检测结果的准确性和可靠性，还应严格按照相关法规和标准进行操作和验证。