『PCR实验污染』的解决办法！

　　PCR污染是每个实验室都多多少少会遇到的问题。原因在于，PCR是非常灵敏的一项检测，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增，从而容易出现DNA污染导致的假阳性。那么，怎样远离PCR的污染呢？

　　图　PCR污染之一瞥

　　首先，要辨别PCR污染的来源。设立阴阳性对照，有利于检测反应体系各成分的污染情况。尤其是设立空白对照，即包括PCR的全部组分，而不加模板DNA，这对检测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。

　　在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，则考虑可能为环境污染。环境污染的最主要原因是DNA溶液的溅出和DNA气溶胶造成的实验区域的污染，这尤其在PCR产物扩增区容易出现。移液器枪头和EP管架是也较常见的污染部位。

　　如果是环境污染，还可对每个区域进行涂抹采样和核酸提取，以最终鉴定污染的区域所在。德国Minerva Biolabs公司专门生产有DNA污染监测试剂盒（货号181-0010和182-0010），比较方便使用。

　　对PCR的环境污染，有如下几种治理方法：

　　1. 用常规消毒液定期在环境中喷雾消毒处理。

　　2. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；其缺点是盐酸对皮肤有一定的腐蚀性。

　　3. 紫外照射法：紫外波长一般选择254/300nm，照射30分钟至2小时。但需要注意的是，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。

　　4. 选用商品化的DNA污染祛除剂。我们推荐的是Minerva公司的PCR CleanTM 喷雾剂、湿巾。其1分钟即起效，方便快捷，效果显著，可同时去除DNA和RNA。作用1分钟后，用纸巾擦拭，即可完成对DNA污染的清除。

　　对于PCR反应液的污染，可采取以下方法：

　　1. DNase I 法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。

　　2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如MspI和TaqI等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h后加热灭活进行PCR。

　　3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法。

　　4. 尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：用dUTP代替dTTP，使PCR产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。

　　图　UNG法预防污染

　　总之，灵敏度越高的PCR反应越容易出现PCR污染。采用适当的措施消除污染，可以避免重复实验和浪费试剂，也使得实验结果更加可靠而精准。

　　参考资料

　　唐艳荣，张海云，等。聚合酶链式反应（PCR）中主要污染源及处理方法的分析。农业开发与装备，2017（3）：99-100

　　周荣荣，李超。日照市疾病预防控制中心PCR实验室污染情况调查。 医学检验与临床， 2017,28（5）：61-63